Vários episódios centram histórias LGBTQ+, incluindo o arco intensificado de bullying de Kurt Hummel e seu encontro com Blaine Anderson, abertamente gay, em "Never Been Kissed", as lutas de Santana Lopez no armário e seu plano para rainha do baile envolvendo chantagem ao valentão Dave Karofsky em "Born This Way", e o desenvolvimento de pares do mesmo sexo como Klaine e Brittana. O episódio "Born This Way" estrutura explicitamente enredos em torno da homossexualidade, autoaceitação via música título de Lady Gaga, e personagens exibindo "falhas" pessoais em camisetas, com a camiseta "Libanesa" de Santana sublinhando a identidade lésbica como um ponto focal. O criador Ryan Murphy declarou sua intenção de usar a série para visibilidade pessoal de personagens gays e para promover a aceitação mostrando famílias e experiências não tradicionais para o público mainstream.

Isso impulsiona arcos de personagens e subplots além da narrativa orgânica, com mensagens explícitas sobre homofobia, bullying ligado à sexualidade e abraçando o "outro". Diversidade racial e de deficiência aparece no elenco (por exemplo, Artie em cadeira de rodas, personagens como Mercedes e Tina), mas o apelo e o peso narrativo da temporada dependem fortemente do enquadramento da política identitária em vez da inclusão incidental. A recepção do público incluiu elogios pela representação ao lado de críticas a sermões pesados, com reações conservadoras às representações da homossexualidade.