Evie serve como a primeira protagonista jogável feminina na série principal com um estilo de jogo focado em furtividade justificado pela dinâmica fraternal e pela lore dos Assassinos, enquanto Jacob é o combatente impulsivo; sua história envolve a libertação de distritos, o recrutamento da gangue Rooks e a busca por uma Peça do Éden sem centrar a política de identidade moderna. Elementos de apoio incluem Ned Wynert, um homem transgênero que atua como doador de missões, e Maxwell Roth, um antagonista cujos avanços em relação a Jacob incluem uma cena de beijo explicitamente enquadrada pelo roteirista principal Jeffrey Yohalem como catalisadora da sexualidade de Jacob, com o desenvolvedor confirmando que não haverá interesse amoroso feminino para Jacob na história principal para preservar esse subtexto.